Az apoptózis
Programozott sejthalál


Összeállította: A Teleki Tehetséggondozó Kollégium TDK-jának 4 tagja Angi Réka, Kaulics Gábor, Kurucz Georgina és Pásztor Péter

Mentor: Dóri Csaba, a Kutató Tanárok Országos Szövetségének tagja, a Kutató Diákok Országos Szövetségének mentora

Köszönetnyilvánítás: köszönet szeretnénk mondani Prof. Dr. Szondy Zsuzsának, aki a legfőbb koordinátorunk volt a kutatómunkánkban, Tóth Katalinnak és Dr. Sarang Zsoltnak, akik a Debreceni Egyetem Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézetének kutatói.

A projektünk célja: Az apoptózis folyamatának megismerése, majd az ezzel kapcsolatos kutatásaink értékelése, elemzése. Ezt laboratóriumi kutatással, szakirodalmazással, konzultációkkal, megfigyelésekkel, külföldi publikációk fordításával, az így megszerzett ismeretanyagnak a munkánkba való beillesztésével szeretnénk elérni, azért, hogy a sejtbiológiának ezt a területét jobban megismerjük. Célunk még a programban résztvevő tanulók laboratóriumi ismereteik fejlesztése, készség szintre való emelése. A külföldi szakirodalmazásban jártasságuk, könyvtárhasználati ismereteik elmélyítése.
A kísérletes munka célja: a retinsavak és nur77 transzkripciós faktor apoptózis indukcióban betöltött szerepének vizsgálata egér tímusz sejtekben

A KUTATÓMUNKÁT MEGELŐZŐ ELMÉLETI ISMERETEK

1. Az apoptózis
A soksejtű szervezeteknek szükségük van arra, hogy megszabaduljanak az életműködésük szempontjából feleslegben lévő, valamint az életfolyamatokat akadályozó, vagy az azokra veszélyes sejtektől. Ez leggyakrabban a programozott sejthalál révén történik meg . E jelenség kutatásának kezdetét 1972-re teszik, ekkor jelent meg Kerr, Wyllie és Currie mérföldkőként számon tartott cikke, amelyben a sejthalál e formáját apoptózisnak nevezték el. Görögül falevelek hullását jelenti. Az apoptózis nem ugyanaz, mint a nekrózis /= elhalás, visszafejlődés, zsugorodás/, mivel a nekrózis mindig kóros.

1. 1 A programozott sejthalál fogalma:
Meghatározott sejtek, vagy sejtcsoportok időben, vagy térben meghatározott eltűnése előre megjósolható. Ezt eddig főként fonálférgeken és ecetmuslicákban kutatták
Az régen ismert, hogy az emberi szervezet közel 1015 sejtjéből naponta 109 elhal, illetve újonnan született sejtekkel cserélődik le. Különösen élénk ez a sejtcsere a csontvelőben és a bélnyálkahártyában, de a májunk is teljesen kicserélődik 1 év alatt. A programozott sejthalál elengedhetetlen a szöveti homeosztázis /egyensúly/ fenntartásához. A megfelelő funkciójú és számú sejteket a sejtosztódás és a sejtelhalás egyensúlya tartja fenn. A sejtelhalás megtörténhet a sejthalál apoptózis és autofágia (önemésztődés) programjának elindításával is.
Vannak speciális sejthalálformák is, ezekben az elhalás folyamata csak részben zajlik le, és a félig elhalt sejt átmenetileg meghatározott funkciót lát el, ilyen például a vörösvértestek, melyeknek a feladata az oxigénszállítás a szövetekig, jellemzője a vörösvértestekre, hogy nem rendelkeznek sejtmaggal. Élettartam 120 nap. De ilyenek a keratinociták /feladatuk a bőr védőrétegének biztosítása/, vagy az életünk végéig bennünk maradó sejtmag nélküli szemlencsesejtek. Ezen speciális sejthalálformákat az apoptózissal együtt természetes sejthalálformáknak nevezzük

1. 2 Az apoptózis morfológiája
Az apoptózis a sejtelhalás olyan formája, amely kaszpázok aktiválódásán keresztül indul el és jellegzetes morfológiai változásokkal jellemezhető.

1. Az elhaló sejt fokozatosan elválik a környező sejtektől
2. Megszűnik a kapcsolata az extracellulális mátrixszal /= a sejtet körülvevő döntően kötőszövetes anyaggal/
3. Plazmamembránján (a sejtet körülvevő sejthártyán) kitüremkedések jelennek meg
4. Némelyik kitüremkedés idővel visszahúzódik, majd újra megjelenik
5. DNS festéssel láthatóvá válik az apoptózis egyik legszembetűnőbb jelensége, a sejtmaganyag kondenzálódása
6. A kondenzált sejtmag ezek után különálló darabokra esik szét
7. Kisebb változások zajlanak az endoplazmás retikulumban /ER/, melynek szerkezete fellazul /az ER-nek 2 fajtája van: a SER és a DER. A DER-en helyezkednek el a kötött riboszómák, melyeken a fehérjék képződnek. A SER-en nincsenek riboszómák, feladatuk a lipidek szintézise./
8. A sejtplazmában vakuólumok /üregecske/ jelennek meg
9. A Golgi-apparátus és a mitokondriumok általában nem mennek át tényleges változáson
10. Végül a sejt sejthártyával határolt, különböző részeket magában hordozó részekre darabolódik fel

Ezeket a feldarabolódott testeket fiziológiás körülmények között a környező sejtek (professzionális makrofágok és nem professzionális fagocitáló sejtek) felveszik, így azok lizószómálisan /lizoszóma=emésztő űröcske/ lebomlanak. A fagocitózis folyamatához egyrészt nélkülözhetetlenek az elhalt sejt sejthártyájának molekulái, másrészt az ezeket felismerő fagocitáló sejtek felületén elhelyezkedő receptorok, közülük is főként azok a receptorok, amelyek képesek megkötni, vagy magához láncolni az elhalt sejt sejthártyáját.
A fagocitózis eredményeként a makromolekulák nem tudnak kiáramlani a sejtközötti állományba, és így nem következik be gyulladás, ami egyébként a fizikai károsodásra elhaló sejtek pusztulását kíséri és a környező szövetek károsodásához vezet. Az apoptótikus sejtek egyébként fagocitózis nélkül is gyulladás gátló hatásúak, mert a fagocitákhoz kapcsolódva aktívan gátolják akár a baktériumok által kiváltott gyulladási mediátorok termelődését is.

1. 3 A morfológiai változások biokémiai háttere
Az apoptózis során megfigyelhető morfológiai változások elindításáért a végrehajtó kaszpázok aktiválódása felelős. A kaszpázok cisztein aktív centrummal rendelkező aszpartát mellett hasító poteázok (fehérje hasító enzimek), amelyek mai tudásunk szerint legalább 500 fehérje specifikus hasításán keresztül aktiválják a teljes apoptózis programot.

1.3.1 A sejtmagban zajló változások mögött álló biokémiai folyamatok
Az apoptózis során a DNS illetve a sejtmagi fehérjék feldarabolódnak. Az örökítőanyag darabolódásakor a DNS kezdetben 30-50 kilobázis majd 200-300 bázispár nagyságú darabokra emésztődik. A kromoszómális DNS hasítását a kaszpáz enzim által aktivált DN-áz (CAD) (DNS bontó enzim) végzi. Ezt az enzimet egy gátló fehérje (ICAD) mindaddig inaktív állapotban és a citoszólban tartja, amíg azt róla a kászpáz-3 le nem hasítja. Amikor az inhibitor lebomlik, a DN-áz a sejtmagba jut, és ott megkezdi hasító munkáját. Hatását segíti a mitokondriumból kijutó AIF (apoptózis indukáló fehérje) fehérje is, amely nagyobb tömegű DNS darabok képződését eredményezi. A DNS emésztésével párhuzamosan megkezdődik a sejtmagi fehérjék lebontása /például: a DNS-t borító hisztonok, a magi membránban található lamin, valamint a DNS hibajavítását elősegítő PARP /poli-ADP ribozil polimeráz/. Mindhárom fehérje bontásában ugyancsak kaszpázok vesznek részt.

1. 3. 2 A sejt alaki és szerkezeti változása
Mint fentebb leírtuk, az apoptózis kezdetén a sejtmag kondenzációjával párhuzamosan a sejthártyán kitüremkedések jönnek létre. A kitüremkedéseket a citoszkeleton szerkezeti fehérjéinek /aktin, miozin/ átszerveződése okozza. A citoszkeleton egy olyan hálózatos rendszer, amely az állati sejteket merevíti, ez a rendszer két, az izmokban is megtalálható fehérjemolekulából az aktinból és a miozinból épül fel. Ezek védik az állati sejtet az összenyomódástól. Mivel ez hálózatos elrendeződésű, ezért az állati sejtet gerendaszerűen merevíti. Ez a rendszer apoptózisnál átrendeződik kitüremkedéseket hozva létre. Az átrendeződést szintén a kaszpáz nevű enzim generálja. Eredményeként, az apoptotikus sejtek elkülönülnek a környező sejtektől.

1. 3. 3 Egyéb sejtorganellumok morfológiai változásainak biokémiai háttere
A mitokondriumról az apoptózis során intenzív fehérjekiáramlás fog bekövetkezni, mivel megnyílnak a mitokondriumhártyák csatornái. Ezek kialakításában a sejthalál elindításában résztvevő Bcl-2 fehérjecsaládtagok a Bax és a Bak fehérje vesz részt sejthalált kiváltó hatásokra. A kiáramló fehérjék kulcsszerepet töltenek be az indító kaszpázok (kaszpáz 9 aktiválásában a citokróm c) aktiválásában, a kaszpázokat folyamatosan gátló inhibitor fehérjék hatástalanításában (OMI), illetve a DNS bontás elindításában (AIF). Az apoptózis későbbi szakaszában megfigyelhető a mitokondriumok hasadása.


1.4 Az apoptózis program elindítása

1.4.1 Sejthalál receptorok (külső sejthalál út)
Német és japán kutatók olyan antitestek keresésekor, amelyek elölik a tumorsejteket, találták meg az első olyan receptort, amely beindítja az apoptózist. Ezt elnevezték APO-1-nek illetve egér sejteken Fas-nak. Később kiderült, hogy ezekből a receptorokból komplex családok vannak jelen a különböző sejtek felszínén. E receptorok ligandjai / ligand: olyan molekula, mely specifikus sejtfelszíni receptorral képes kapcsolatot teremteni/ a sejtek (ugyanazon vagy más, gyakran T ölő sejt) felszínén helyezkednek el és három alegységből állnak. A ligand bekötődése aktiválja e receptorokat oly módon, hogy a kötést követően az alegységek is trimerizálódnak, s magukhoz kötnek egy adapter fehérjét. A kötődött adapter fehérje egy kaszpázt fog aktiválni, ami lehet kaszpáz-8, vagy kaszpáz-10. Ezek a sejthalált indító kaszpázok, amelyek képesek hasítani a végrehajtó kaszpázokaz (kaszpáz-3,-6,-7-et), melyek ettől aktiválódnak. A végrehajtó kaszpázok a sejtekben inaktív formában vannak jelen. Ez az inaktivitás annak tulajdonítható, hogy található bennük egy peptid szakasz, amely nem engedi, hogy ez a három kaszpáz aktív enzimmé tudjon alakulni. Amikor ez a gátlószakasz az indító kaszpázok hatására lehasad, kialakul az enzimeknek az az aktív konformációja, amely működni tud. Az effektor kaszpázok aktivációja aztán elindítja az 500 fehérje hasadásával járó sejthalálprogramot.


1. 4. 2 A mitokondrium és az apoptózis (belső sejthalál út)
A kutatók sokáig abból indultak ki, hogy a mitokondrium az elektromikroszkópikus képek tanúsága szerint az apoptózis során ép marad, tehát nem lehet szerepe a programozott sejthalál molekuláris eseményeiben, szemben a nekrózist kísérő drámai változásokkal (pl.: nagymértékű duzzadás, az ATP termelőrendszer összeomlása). 1995-ben azonban megfigyelték, hogy az apoptózis korai szakaszában jelentősen megnőtt a mitokondrium hártyájának áteresztőképessége, és onnan olyan fehérjék, (például a citokróm C--az élet olyan alapvető vastartalmú fehérjéje, mely többek között a terminális oxidációban játszik alapvető elektronszállítási feladatot) szabadulnak ki, amelyek beindítják az apoptózist. Hamarosan azonosították azokat a fehérjéket is, amelyek a mitokondriális áteresztőképesség szabályozásában vesznek részt: ezek a Bcl-2 (B sejt leukémiát okozó 2-es gén) fehérje család különféle tagjai. Ezeknek a fehérjéknek három csoportja van.
1. A sejthalálgátló fehérjék (Bcl-2, Bcl-xL) védik a mitokondrium intaktságát. Hatásukat úgy fejtik ki, hogy fehérjepárokat képeznek a sejthalált kiváltó tagokkal, és azok mitokondrium membránba történő bejutását és csatornává történő összeállásukat gátolják. A párosodás során az egyik fehérje BH3 (Bcl család homológ) doménje a másik fehérje BH1, BH2 és BH3 doménje által képzett zsebbe illeszkedik bele.
2.A sejthalált kiváltó Bax és Bak fehérjék (amennyiben a gátló tagok nem gátolják őket) a mitokondriumba jutva csatornát képeznek. Ezen csatornák olyan átmérőjűek, hogy a mitokondriumból képes kijutni a citokróm c, amely kijutva hozzákapcsolódik a kaszpáz-9-es indítófehérjéhez és doxiATP valamint APAF fehérje jelenlétében aktiválja azt. Innentől kezdve az aktív kaszpáz-9-es ugyanúgy képes hasítani a végrehajtó kaszpázokat, mint a kaszpáz-8 és 10. A citokróm c hatását fokozzák egyéb a mitokondriumból kiáramló fehérjék is (lásd fentebb).
A sejthalált elindító csak BH3 domént tartalmazó fehérjék. Ezek elősegítik a BAX/BAK fehérjék csatornát létrehozó képességét oly módon, hogy beilleszkednek BH3 doménjükkel a védőtagok zsebébe, ezáltal felszabadítják a sejthalált kiváltó tagokat a gátló párokból, és azok bejuthatnak a mitokondriumba és szabadon csatornát képezhetnek.

1.4.3 Az apoptózist kiváltó jelek hatásmechanizmusa
Mai tudásunk szerint az apoptózist kiváltó hatások, induljanak azok a sejt belsejéből (nagymértékű DNS károsodás), vagy a sejt környezetéből, a fentebb leírt két sejthalál út egyikét, vagy akár mindkettőt együtt aktiválják.
A mitokondriális út szabályozásában az egyik lehetőség, hogy a védő Bcl-2 szintje lecsökken, vagy pedig a kikapcsolódik ( elhasad a fehérje és ezáltal apoptózis kiváltóvá válik, vagy foszforilálódik, emiatt működésképtelen lesz). Azok a szignálok, amelyek elindítják az apoptózist, úgy is működhetnek, hogy növelik a Bax/Bak fehérjéknek a mennyiségét (ha túl nagy mennyiség van a Bax/Bak-ból, akkor a Bcl-2 nem tudja leközömbösíteni a hatását). Végül sok jel a sejtben inaktívan tárolt csak BH3 domént tartalmazó fehérjét aktiválja (Bid fehérje proteáz hatásra lesz aktív, Bim leválik a sejtvázról, Badről lehasad egy gátló foszfát) vagy mennyiségét növeli.
A sejthalál receptor út kiváltásához a sejthalál receptor és ligand megjelenését, esetleg az indító kaszpázt gátló inhibitor mennyiségét kell szabályozni.

1. 4. 4 A sejtpusztulás mechanizmusa, ezen belül sejthalál kaszpázokkal és nélkülük
A mai napig nem megválaszolt kérdés, melyik az a biokémiai esemény, ami elpusztítja a sejtet, illetve melyik az a pont, ahol az elhalás folyamata irreverzibilissé válik. A sejthalál receptorok gátlása, a sejthalál receptorokkal indított indító kaszpázok inaktiválása teljesen meggátolja a sejthalál folyamatot. A mitokondriális út működése bonyolultabb. A kaszpáz 9 gátlásával ugyan meggátoljuk az apoptózis morfológia kialakulását, de a sejt nekrózissal mégiscsak elpusztul. A Bax/Bak fehérjék együttes kiütése viszont minden sejtet megvéd a mitokondriális apoptózist kiváltó jelekkel szemben. A sejthalál elindításának tanulmányozása jelenleg is a daganatkutatás intenzív irányvonala.


2.A fehérvérsejtek típusai
A fehérvérsejtszám 6-8 G/l. Ez az érték 10 G/l-ig normálisnak tekinthető. A fehérvérsejtek /leukocyta/ alakja meglehetősen változatos, nagyságuk 5-20 µm között változik.
A fehérvérsejtek két nagy csoportba sorolhatók: granulociták és agranulociták

2. 1 Granulociták:
Közös jellemzőjük, hogy plazmájukban szemcsék /granulum/ találhatók, amelyek speciális festéssel mikroszkóp alatt jól láthatóvá tehetők. A granulociták csoportjába tartozó fehérvérsejtek a vörös csontvelőben képződnek. A vérben csak rövid ideig tartózkodnak, onnan a szövetekbe kerülnek, ahol még néhány napig élnek. A keringő vérben nem teljesen érett granulociták is találhatók, ilyen a fiatal alak /jugend forma/, valamint a pálcika alak /Stab forma/. Az érett granulocitákat szemcsenagyságuk, festődésük /May-Grünwald-Giemsa-festés/, valamint a mag alakja alapján három csoportba oszthatjuk:
Neutrofil granulocita – 12 µm nagyságú
Eosinofil granulocita – 13 µm nagyságú
Bazofil granulocita – 10 µm nagyságú
A granulociták szerepe: működésük meglehetősen szerteágazó. A neutrofil granulociták legfontosabb funkciója a szervezetbe került baktériumok elleni védekezés. Ezek a sejtek felismerik a baktériumokat, majd amőboid mozgással megközelítik és bekebelezik /fagocitózis/ azokat. A bekebelezett baktériumokat, a neutrofil granulociták bontó enzimjeik, valamint más anyagcseretermékeik segítségével pusztítják el.
Az eozinofil és bazofil granulociták az allergiás reakciókban játszanak fontos szerepet, mivel szemcséikben hisztamint, szerotonint, leukotriént, prosztaglandint tárolnak. Az allergiás reakció tüneteit a szemcsékből kiszabaduló anyagok idézik elő.

2. 2 Agranulociták
A fehérvérsejtek másik nagy csoportját az agranulociták képezik. Ebbe a csoportba tartoznak a nyiroksejtek /limfociták/ és a monociták.
A nyiroksejtek a vöröscsontvelőben keletkező előalakokból, a csecsemőmirigyben, a nyirokcsomóban, a mandulában és a belek falában lévő nyiroktüszőkben képződnek. Élettartamuk változó, vannak az ún. rövid életű limfociták, amelyek élettartama 1-2 hét, de vannak több évig élő limfociták is /elsősorban az ún. emlékező, azaz memóriasejtek/.
A limfocitákat osztályozhatjuk:
- nagyság alapján megkülönböztethetünk kis- és nagy limfocitákat
- eredet és működés szerint T- és B-limfocitákat

2. 2. 1 A monociták
A monociták a makrofágok és a dendritikus sejtek előalakjai. A makrofágok és a dendritikus sejtek az érpályából kilépve a szöveti térben az elhalt sejtek és a mikroorganizmusok fagocitózisában vesznek részt. A makrofágok szabályozzák a gyulladás és sebgyógyulás folyamatát a neutrofil leukocitákkal együtt, és eltakarítják a sok szöveti maradékot elhalt sejtet, míg a dendritikus sejtek feladata az általuk bekebelezett sejtekből történő antigén (a fagocitózist követő fehérjelebontásból származó peptidek) bemutatása a limfociták számára, és idegen fehérjéből származó peptid esetén a limfociták aktiválása. E sejtek a fagocitózist követően a nyirokcsomóba jutnak vissza, ahol találkoznak a T és B limfocitákkal.

2. 2. 2 B-limfociták
Csontvelői előalakokból lépben, nyirokcsomókban képződnek. Fejlődésük független a T-limfocitákétól. Feladatuk az antitestes vagy másnéven humorális /= folyadéktéri/ immunválasz. Betolakodók /antigének/ hatására a B-sejtek plazmasejtekké alakulnak, s ellenanyagot, immunglobulint termelnek. Az ellenanyagok a vérplazmában találhatók, kémiailag IgG, IgA, IgD, IgE, és IgM.

2.2.3 T-limfociták
A csecsemőmirigyben fejlődnek és érnek, feladatuk, biztosítják a sejtes, vagy másnéven celluláris immunválaszt /cellula = sejt/. A T-limfociták felismerik a szervezetben megjelenő idegen antigéneket (antigén = minden testidegen anyag, pl.: vírus, baktérium, testidegen fehérjék). Képesek különbséget tenni a testünk saját és nem saját anyagai között. A testidegen anyagok ellen immunreakciót indítanak meg. A CD8 T-sejtek fagocitózisra, azaz bekebelezésre nem képesek, ölő hatásukat elsősorban a sejthalálprogram aktiválásával érik el. Rosszindulatú daganatok elleni védekezésben felismerik a daganatsejt felszínén megjelenő a szervezet számára idegen mutáns fehérjék lebontási termékeit, vagy vírussal fertőzött sejtek esetében a vírusfehérjék lebontási termékeit, és a daganatos vagy vírussal fertőzött sejtet elölik. A CD4 T sejtek viszont antigének hatására interleukinokat termelnek, amelyek az immunrendszer teljes működését aktiválják és szabályozzák.
A T-sejt működéséhez két fontos fehérjét fejez ki a felszínén: a T-sejt receptort, valamint a CD4 (helper), vagy CD8 (killer) receptort. (A CD rövidítés az angol cell differentiation marker szavakból származik). A T sejt receptor (amely maga is több fehérjeláncból áll) az MHC molekulák zsebében bemutatott, a fehérjék lebontásából származó peptidekhez tud kötődni, s ha a kötődés erős a T sejt aktiválódni fog. A CD4 és a CD8 pedig megszabja, hogy az MHCI vagy az MHCII molekulákhoz tud-e kapcsolódni a T sejt. A CD8 az MHC I, a CD4 az MHC II molekulákhoz való kötődést, és így az ahhoz kötött peptid felismerését teszi lehetővé.
Azok a T sejtek, amelyeken CD8 molekula van (a CD8 molekula az ölő T-sejtekre jellemző) úgy működnek, hogy minden sejtet megvizsgálnak, hogy a sejt felszínén lévő MHC-I molekulában milyen peptid található. (Az MHC rövidítés az angol major histocompatibility complex szavakból tevődik össze). A sejtek mindig lebontják és újraépítik saját fehérjéiket. Minden lebontott fehérjéből peptiddarabokat juttatnak fel a sejtfelszínükre az MHC I zsebéhez kötve, így a T ölősejtek folyamatosan ellenőrizni tudják, hogy milyen fehérjék vannak a sejtjeinkben. Idegen fehérje, illetve az annak lebontásából származó peptid akkor kerülhet az MHCI zsebébe, ha a sejtjeinkben vírus szaporodik, vagy a saját fehérjénk mutálódik, ami rákos sejt kialakulásához is vezethet. A szervezetünkben mindig van legalább egy (sokszor több száz) olyan T-sejtünk, ami a kijuttatott idegen peptid/MHC-vel össze tud kapcsolódni. A kapcsolat úgy jön létre, hogy az MHC-I és a CD8, valamint a TCR és az MHC/peptid is szorosan összeilleszkedik. Ekkor a T-sejt aktiválódni fog, és elöli ezt a veszélyes sejtet. Ha lenne a testünkben olyan T-sejt is, amely a saját peptid/MHC komplex ellen tartalmazna T-sejt receptort, akkor az súlyos problémákhoz vezetne, ugyanis ebben az esetben a saját egészséges sejtjeink pusztulnának el. Ezért már a kezdet kezdetén az ilyen sejtektől meg kell szabadulnunk. Ez a negatív szelekció lényege, amely a T sejtek fejlődésének kezdetén a tímuszban apoptózissal zajlik.
A CD4 segítő T sejtek működése hasonló. Ezek azonban a nyirokcsomóba vándorolt fagocitózisra képes dendritikus sejtek által az MHCII zsebében bemutatott peptidekre aktiválódnak. Ezek a peptidek a fagocitált sejtek (saját sejtek és mikroorganizmusok) fehérjéinek lebontásából származnak. A fagocitózissal felvett sejteknek a lebontása, s a fehérjéiknek a lebontása máshol történik meg, mint a saját fehérjéké, a lizoszómákban. Ezért, más úton (MHC II-höz kötve) kerülnek ki a sejtből. Azaz míg a CD8 sejtek minden sejtet ellenőriznek, a CD4 sejtek csak azokkal a sejtekkel tudnak kapcsolatba lépni, amik fagocitáló tulajdonságokkal rendelkeznek. Itt is veszélyes lenne, ha lennének olyan CD4 sejtjeink, amelyek a saját sejtek fehérjéire aktiválnák az immunrendszert. Ezért a saját ellen aktiválódó (autoimmun) CD4 T sejteket is ki kell szelektálni és elölni a T sejtek fejlődése során.


3.A tímusz és az apoptózis

3.1 Negatív és pozitív szelekció a tímuszban
Összefoglalva, a tímikus kiválogatódás során olyan sejtektől szabadulunk meg a tímuszban, ami a saját peptid/MHC komplexek ellen működnének, és a sejtjeinket elölnék. A T-sejteknek a képzése a következőképpen történik: a csontvelőben kialakul egy előalak, amely a tímuszba vándorol és ott érett T sejtekké ér. A fejlődés során különböző stádiumokon megy keresztül, melynek során először létrehoz egy T-sejt receptort. A T-sejt receptor minden T sejtben véletlenszerűen generálódik a kromoszómán levő speciális génszakaszokból, amelyek teljesen valószínűségi alapon illesztődnek össze. Minden egyes T-sejt, ami keletkezik, abban különbözik a másiktól, hogy rajta milyen T-sejt receptor található. Ez a T-sejt receptor potenciálisan vagy MHC-I vagy, MHC-II molekulához tud kapcsolódni, vagy egyáltalán nem tud az MHC molekulákhoz kapcsolódni. Ez előre kiszámíthatatlan, ezért ebben a stádiumban a timocita mind a CD4, mind a CD8 molekulákat kifejezi. Ebben a fejlődési stádiumban történik meg a kiválogatódás, amely a tímuszban szintén megtalálható epiteliális sejtekkel történő kölcsönhatás eredményeként jön létre. Az epiteliális sejtek mind MHC-I, mind MHC-II molekulákkal rendelkeznek és képesek arra, hogy nemcsak az epitheliális, hanem a teljes testre jellemző összes fehérje peptidjeit bemutassák a fejlődő timocitáknak Ennek az lesz a következménye, hogy az éretlen timocita, elvben találkozni fog minden olyan peptiddel
/miközben végigtapogatja az epitheliális sejteket/, ami szervezetünkben található.
A véletlenszerűen képződő T-sejt receptorok (és az őket hordozó T sejtek) 90%-ban általában hibásak, mert nem tudnak kapcsolódni az MHC molekulákhoz. A T sejt receptor/epitelsejt interakció hiánya miatt ezek a sejtek elhalnak apoptózissal. Elhalásukat fokozzák az epiteliális sejtek által termelt sejthalált kiváltó jelek.
A jól működő, megfelelő felépítésű T-sejt receptorok, mely, mint fentebb említettük, csak a 10%-át teszik ki a T-sejteknek, ezek képesek kapcsolódni vagy az MHC-I vagy az MHC-II molekulához. Ha ez a kapcsolat létrejön, megtörténik a szelekció. Abban az esetben, hogyha a saját peptiddel nem reagál, akkor tovább fog differenciálódni érett T sejtté. Az hogy CD4 vagy a CD8 irányba-e, az attól függ, hogy az MHC-I vagy az MHC-II molekulához kapcsolódik-e a T sejt receptor. Ha az MHC-I-hez, CD8 irányba, ha az MHC-II-höz tud kapcsolódni, CD4 irányba alakul át. A pozitív szelekció során megjelenik benne a Bcl-2, ami megvédi a tímusz epiteliális sejtjeiben keletkező, a használhatatlan timocitákat ölő sejthalál szignálokkal szemben. Abban az esetben viszont, ha egy erős reakció alakul ki az MHC molekulák és a peptidek között, ami saját peptid, akkor elindul az apoptózis, és e saját sejtek ellenes T sejtek negatív szelekcióban kiszelektálódnak.
Ha végiggondoljuk, ennek az előszelekciónak az lesz az eredménye, hogy nem lesz egyetlen olyan T-sejt sem a periférián, amelyik ne tudna hozzákötődni az MHC molekulákhoz, és csak olyan T-sejt fog kijutni a tímuszból, amelyik a szervezet saját peptidjeivel nem reagál. Viszont képezhetünk akár millióféle különféle T-sejtet is, ami lehetővé teszi, hogy akár millióféle előre nem prediktálható idegen peptidet is felismerjünk és arra megfelelő immunválaszt adjunk.

3.2 A negatív szelekciót kiváltó apoptótikus molekulák
A negatív szelekció során az apoptózist ténylegesen kiváltó molekulák közül kettőt azonosítottak. Az egyik a Bim, csak BH3 fehérje, amely a Bcl-2 fehérje hatását közömbösíti. A másik a Nur77 transzkripciós faktor. Ez a faktor egy olyan fehérje, amely rá tud kötődni különböző gének szabályozó szakaszára, és azon gének átíródását elindítja. . A Nur77 transzkripciós faktort bejuttatták a tímusz sejtjeibe és megvizsgálták azt, hogy ha jelen van, mi történik. Azt tapasztalták, hogy ha csak ezt az egyetlen egy fehérjét túltermelik a tímuszsejtekben, akkor több sejt hal el a tímuszban, mint normális esetben. Három olyan fehérjét találtak, amelyek a sejthalál kiváltásáért felelős és a Nur77 szabályozza megjelenésüket. Ilyen a Fas ligand és a TRAIL, melyek a sejthalál receptorokon keresztül váltanak ki sejthalált. Valamint találtak egy eddig nem ismert gént, melyet karakterizáltak. Ezt nevezték el később Nur77 függő gén-1 (NDG1)-nek, mely szintén apoptózist indukál a kaszpáz 8 aktivációján keresztül.


4. A tímikus epiteliális sejtek retinoidokat termelnek

4.1 A retinsavak képződése A vitaminból
Régóta ismert, hogy az A vitamin hiánya súlyos immunhiányos állapotot eredményez. A vitamin hiányos diétán tartott állatokban az immunhiányos tünetek rendezhetők az A vitamin retinsav származékainak (transz-retinsav, 9-cisz retinsav) adásával, ami arra utal, hogy ezen vegyületek közvetítik az A vitamin hatását az immunrendszerre. A retinsavak két lépésben keletkeznek A vitaminból: az első lépést aldehid dehidrogenázok, a második lépést a retinaldehid dehidrogenázok katalizálják. A keletkező transz-retinsav nem enzimatikus úton, spontán alakul 9-cisz retinsavvá.
Lipidoldékony molekulák révén a retinsavak a sejtben celluláris retinsavkötő fehérjékhez (CRABP) kötve találhatók. A CRABPI inkább a lebontásukat segíti, míg a II-es a magba transzportálja őket, ahol génátíródásra gyakorolt hatásukat kifejthetik. A Szondy Zsuzsanna laboratóriumában, közelmúltban folyt mérések kimutatták, hogy a tímusz tárol A vitamint, és azt is, hogy a timociták szelekcióját irányító epitelsejtek képesek A vitaminszármazékok szintézisére. A keletkező retinoidok pedig olyan koncentrációban keletkeznek a tímuszban, ami lehetővé teszi, hogy génátíródást szabályozzanak.

4.2 A retinsavak hatásának molekuláris mechanizmusa
A retinsavak olyan lipidoldékony molekulák, amelyek a sejtmagban található szteroid/tireoid/ retinoid receptorcsaládba tartozó transzkripciós faktorok működését szabályozzák. A kromoszómáinkon található gének átíródása úgy szabályozódik, hogy a géneken vannak a különböző szabályozó fehérjéket megkötő szekvenciák, melyeket promóter szekvenciáknak nevezünk. Ezek a transzkripciós faktor kötőhelyek. Ha a transzkripciós faktorok hozzájuk kötődnek, akkor elindítják a megfelelő mRNS-nek az átíródását a DNS-ről. A retinoid receptorok is ilyen transzkripciós faktorok, amelyek akkor kapcsolnak be, hogyha rájuk kötődik a retinoid. Működésük során magukhoz kötnek olyan fehérjéket, amelyek fellazítják a DNS-t körülvevő fehérjeszerkezetet, így szabaddá válik az út az mRNS képződését elősegítő RNS polimeráz DNS-hez történő kötődéséhez. Összefoglalva a retinoidreceptorok feladata az, hogy ha retinoid érkezik és rákötődik a retinoid receptorra, kezdjék el a megfelelő gének átíratását.

4.3 A retinsavak nem szelektált éretlen timocitákban apoptózist váltanak ki
A Szondy Zsuzsanna laboratóriumában korábban végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a timociták is kifejezik a retinoid receptort, és retinsavak adása dózisfüggően apoptózist vált ki timocitákban. Ha megnézzük /a sejtek festhetőek/, hogy kezelés előtt mennyi T-sejt receptort expresszáló sejt van, majd retinoidokkal kezeljük, akkor látszik, hogy a sok T sejt receptort kifejező érett, kiválasztott sejtek már nem fognak elhalni, védettek lesznek. Viszont amelyik elpusztul, az éretlen kevesebb T-sejt receptort expresszáló, egyébként CD4, CD8 dupla pozitív sejt. Mivel a tímikus epiteliális sejtek termelnek retinoidot, ez jelentheti azt, hogy a retinoidok a tímikus epiteliális sejtek által kibocsátott olyan jelek, ami az MHC-vel kapcsolódni nem tudó, 90%-ban termelődő éretlen timociták sejtelhalását kiváltják. A kísérletek azt is bemutatták, hogy a sejthalál kiváltásában a retinoid receptorok gamma típusa vesz részt, és a sejtelhalás RNS és fehérjeszintézis gátlószerekkel gátolható, ami arra utal, hogy a sejthalál program gének átíródásának a szabályozásán keresztül új sejthalált kiváltó fehérjék szintézisével indul. A kérdés, az hogy hogyan?


5. Vizsgálandó kérdések

Célunk azoknak a géneknek a megkeresése, amelyeket a retinsav kezelés éretlen timocitákban indukál, és amelyek felelősek lehetnek a sejthalál kiváltásáért. A Szondy Zsuzsanna laboratóriumában perifériás T sejteken végzett korábbi kísérletek kimutatták, hogy retinoidok indukálják a korábban a negatív szelekcióhoz kötött Nur77 transzkripciós faktor megjelenését. Ezen megfigyelés alapján vizsgálták, hogy megjelenik-e egér timocitákban is retinsav kezelés hatására. Azt találták, hogy a transzkripciós faktor itt is indukálódott. Kulcsponti szerepét pedig úgy bizonyították, hogy megvizsgálták, kiváltható-e a sejthalál olyan mesterségesen módosított egerek timocitáiban is, amelyekből a Nur77 fehérje génjét eltávolították. Ezekben a timocitákban a sejthalál nem volt kiváltható. Elegendő-e a Nur77 indukciója a sejthalálhoz, vagy más gének is kellenek? Milyen géneket szabályoz a Nur77 a retinoid kiváltotta sejtelhalás során? A kérdés megválaszolásához meg fogjuk határozni az összes olyan ismert gént, amely retinsav hatására indukálódik és összehasonlítjuk azokkal a génekkel, amelyek a Nur77 hiányos timocitákban indukálódnak (globális génanalízis). Az első géncsoport megadja a retinoidra indukálódó gének összességét (reméljük közöttük látjuk a Nur77 gént is – belső kontroll), a második (Nur77 hiányos) géncsoportban pedig nem fognak azok a gének indukálódni, amelyekhez a Nur77 transzkripciós faktor függően jelennek meg. Így el tudjuk különíteni a retinoid és Nur77 függő géneket.


AZ APOPTÓZIS KÍSÉRLETI VIZSGÁLATA

A tudományos kutatómunkánkat a Debreceni Egyetem Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézetében a fentiek megismerése után kezdtük el. Nagyon sok segítséget kaptunk Tóth Katalin kutatónőtől, aki bevezetett bennünket a laborban használatos vegyszerek, eszközök használatának rejtelmeibe. A kutatómunkánk gyakorlati szakasza ezzel elkezdődött.

1 A kutatási módszer ismertetése
A retinsav által kiváltott timocita sejtelhalás génprogramjának vizsgálata egér timocitákban. A vizsgálatokhoz 0.3 mM 9-cisz retinsavval kezelt egér timocitákból 0 és 6 órával a kezelést követően RNS-t tisztítunk, majd a tisztított RNS minták mRNS-einek koncentrációját, mennyiségét NanoDrop fotométerrel megmértük. Affymetrix analízissel hasonlítjuk a nem kezelt thymocyták mRNS-einek mennyiségéhez. Az RNS minták tisztítása a DEOEC Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézetében történik, Szondy Zsuzsa Professzornő segítségével. Az Affymetrix analízist (globális génanalízis) egy német cég végzi.

2. Konkrét tevékenységek:
Irodalmazás a sejtelhalás és a génreguláció tárgykörében, DNS „chippelek” elkészítése, a kapott eredmények értékelése, azaz a 9-cisz-retinsav indukált génexpresszió mintázat meghatározása. A diákok feladata a kapott génmintázatok elemzése. Ki fogják a korai gének közül válogatni azokat, amelyeknek retinoid kezelés hatására megváltozott az expressziós szintje.

3 A vizsgálat menete

3.1 Az RNS izolálása
A kísérletben a Debreceni Egyetem Biokémiai és Molekuláris Biológia Intézetének kísérleti állatházából származó Nur77 knock out és vadtípusú egereket használtunk. Éteres túlaltatást követően az egerek tímuszát eltávolítottuk és steril szűrön átnyomkodva sejtszuszpenziót állítottunk elő belőle. Mintánként 108 db. sejtet 20 ml RPMI 1640 tápoldatban 37°C-os inkubátorban tartottuk és 0,3mM 9-cisz-retinsavval kezeltük. 6 óra elteltével a sejtekből TRIzol reagenssel /GIBCO BRL/ RNS-t izoláltunk. Ennek során a foszfát puferrel mosott sejtekhez 1 ml TRIzol reagenst adtunk, majd a sejtlízis után 200 ml kloroformot adtunk a mintákhoz és centrifugába tettük 4°C-on 15000 rpm-mel centrifugáltuk 15 percig. A centrifugálás után a színtelen felső fázist új csőbe vittük át, 500 ml izopropanolt adtunk hozzá, és 10 percig hagytuk szobahőn állni majd 4°C-on 15000 rpm -mel centrifugáltuk 10 percig. A centrifugálás után a csapadékot 100ml 70%-os alkohollal mostuk, és steril fülkében megszárítottuk. A száraz RNS csapadékot 20ml RN-áz mentes vízben oldottuk be. Az RNS koncentrációkat NanoDrop fotométerben határoztuk meg és 500 ng/ml-re állítottuk be. A preparátum minőségét RT-PCR technikával ellenőriztük. Az RNS mintákat -70°C-on tároltuk Németországba való küldésükig.

3.2 RT-PCR (reverz transzkriptáz –polimeráz láncreakció) elve
Mullis az oligonukleotidok felhasználására irányuló vizsgálatai közben döbbent rá arra, hogy ha a DNS-függő polimeráz reakciót két megfelelő oligonukleotid primer jelenlétében többször megismétli az eredeti DNS szekvencia egy része megsokszorosítható (PCR). Ehhez egy kettősszálú DNS targetre, egy DNS polimerázra és két olyan oligonukleotid primerre van szükség, amelyek a DNS két különböző szálával hibridizálnak úgy, hogy a 3’-végük egymással szembenéz.

A reakció lépései a következők:
- A kettősszálú DNS denaturálása hőkezeléssel /95ºC-on/
- A targettel komplementer két oligonukleotid hibridizálása az egyes DNS szálakhoz úgy, hogy az egyikük az egyik, a másikuk a másik szálhoz kötődjön. A kapcsolat stabilizálásához az elegyet le kell hűteni és az oligonukleotidokat nagy feleslegben kell alkalmazni.
- Új DNS szálak szintézise dNTP és DNS polimeráz segítségével. /Az első ciklusban szintetizált szálak hossza nem egységes./
- A ciklus megismétlése. Ekkor a sokszorozandó DNS szakasz megduplázódik. A 3. ciklusban megjelennek azok a kettős szálak, melyeket az oligonukleotidok 5’ végei határolnak. Mivel az egységes hosszúságú termékek száma exponenciálisan növekszik kb. 20 ciklus után ezek lesznek döntő többségben.

A módszerrel a DNS kb. 106-szoros sokszorozása érhető el. Egy idő után az exponenciálisnövekedés leáll, ez az úgynevezett plató effektus.

Egy tipikus PCR ciklus a következő lépésekből áll:
- Denaturálás 92-95 °C-on
- Primerek hibridizálása az oligonukleotidok olvadáspontjából függő hőmérsékleten /Tm – 3 °C-on/
- DNS szintézis 72 °C-on
- Újabb hődenaturálás
Ezt követi a ciklus többszöri megismétlése. A felsokszorozott génszakasz aztán akrilamid gélen egyenáram mellett megfuttatható, a többi DNS darabtól elválasztható, és a felsokszorozott nukleotidszakasznak megfelelő méretű kontroll DNS csík mellett látható (UV fény alatt).

Az izolált RNS-ek minőségét úgy ellenőriztük, hogy a sejtben nagy mennyiségben található ciklofillin gén mRNS-ét reverz transzkriptáz enzim segítségével cDNS-be írtuk át (a reverz transzkriptáz enzim az RNS nukleotidsorrendjét felhasználva azzal komplementer DNS szálat készít). Az így átírt ciklofillin DNS-ek épségét ellenőriztük PCR segítségével úgy, hogy egy 500 kilobázisnyi szakaszt sokszoroztunk fel. Ha az RNS töredezett (nem alkalmas Affymetrix vizsgálatra) akkor ez a nagyon hosszú szakasz valószínűleg szintén töredezett lesz, és nem tud felsokszorozódni.

3.3 A „gén-chip” technológia
A „gén-chip” módszer elve az, hogy egy kis, bélyeg méretű lapra előre meghatározott szerkezetű /azaz nukleotid sorrendű/, 8-20 nukleotidbázisból álló nukleinsav- /oligonukleotid/ szálakat visznek. Egy ilyen lapocska ma már cm2-enként akár 1011 db. DNS szálacskát is tartalmazhat. A lapocska /chip/ előállítása /lásd később/ során a számítógép "megjegyzi", hogy a kétdimenziós rácson /gene array/ melyik pozícióban, milyen nukleotidszerkezet található. Ehhez a chip-hez adják hozzá egy oldatban a vizsgálandó személy sejtjeiből izolált cDNS /komplementer DNS, a minta RNS-ből reverz transzkripció során előállított DNS/ darabokat, amelyeket előzőleg fluoreszcens festékkel megjelöltek. Rövid inkubálás után kimossák a nem kapcsolódó nukleinsavdarabokat. Könnyen belátható, hogy a megfelelő jelölt nukleinsavdarabok csak oda kapcsolódnak, ahol az előbb említett nukleotidbázis komplementaritás teljesül. Más szóval, úgy történik meg az inkubálás majd a mosás, hogy csak azok a szálak kössék meg a nekik megfelelő jelzett nukleinsavdarabokat, ahol teljes a sorrend azonossága. Ezt követően egy "scanning" rendszer leolvassa a világos és sötét pontokból álló mintázatot és már csak az eredmények értékelése van hátra. Itt újra a számítógépé a főszerep, hiszen az "tudja", hogy mely pozícióban milyen génszakasz található. Ha például az egyik rácsponton a HIV jellegzetes génszakaszát helyezték el, és ott pozitív reakciót jelez a leolvasó, ez azt jelenti, hogy a beteg mintájában előfordult ez a vírus. Más chip-eknél, több szín alkalmazása lehetővé teszi, hogy ugyanazon chip-re az egyik beteg, pl. piros festékkel jelzett, és a egy egészséges ember zöld festékkel jelölt cDNS-mintáját hibridizálják. A számítógép a leolvasás után egymásra képes vetíteni a leolvasott mintázatokat. Ott, ahol mindkét esetben /beteg vagy egészséges/ azonos a gén /illetve az ennek megfelelő cDNS-darab/ mennyisége, a zöld és a piros egymásra vetülve sárga színt ad. Ahol hiányzik a betegből a megfelelő transzkript /mRNS/, a zöld szín jelenik meg, ahol csak a betegben van valamely transzkript, ott a piros szín dominál. Jelen kísérletben az Affymetrix rendszerű chip-eket használunk, ahol egy DNS chip-re egy minta kerül felvitelre és a chip-ek kerülnek összehasonlításra egymással oly módon, hogy a kezeletlen és kezelt minták mRNS-einek mennyiségét hasonlítjuk össze.
3.3.1 A „gén-chip” előállítása
Gyakorlatilag lehetetlen lenne előre szintetizálni a több százezer nukleotidszálat és ezután felvinni őket a lapocskára, megfelelő nagy sűrűséggel, egymás mellé. Ehelyett, egy magyar származású kutató, Steven Fodor zseniális ötletével az ún. fotolitográfia technikáját alkalmazzák. Ennek az elve, hogy az üres lapocskát fényre bomló anyaggal borítják, majd egy olyan maszkkal fedik le, amely miniatűr /<1 mikron/ átmérőjű, bizonyos pontokon perforált kis lyukak ezreit tartalmazza, előre megtervezett eloszlásban. Ha ezt követően fénnyel világítják meg a maszkkal fedett lapocskát, csak ott jön le a fotolabilis anyag, ahol a kis lyukak helyezkedtek el. Ezzel egyidejűleg az egyik a fotolabilis molekulával kapcsolt nukleotidot /pl. A/ hozzáadják a rendszerhez, amely így kapcsolódni képes a fény által szabaddá tett pozícióhoz. Ugyanezt három másik, más perforációs mintázatot hordozó maszkkal /C, T, G/ megismételve a teljes lapocska fedve lesz kötött nukleotidokkal. Minthogy a nukleotidok fotolabilis anyagot hordoznak, további négy maszk egymás utáni adásával, megvilágítással és a megfelelő nukleotid adagolásával felépíthető a második, harmadik, stb. "emelet", Tehát például egy 10 "emeletes" oligonukleotid 10 x 4 = 40 maszkot, negyven megvilágítást és minden negyedik ciklusban ugyanazzal a nukleotiddal való inkubációt jelenti. Ez nem több mint ciklusonként egy perc, tehát példánkban 40 perc alatt készül el egy „gén-chip”. Minthogy a maszkok perforáltsági mintázatát a számítógép tervezi, az tudni fogja, hogy mely pozíción milyen "emeletek" következtek egymás után, tehát az in situ szintetizált oligonukleotid szál sorrendjét. Így már az is érthető, hogy a leolvasáskor /lásd előző rész/ az egyes pontok pozitivitása milyen génnek, mely génszakasznak felelt meg. Az előállítás tehát úgy történik, hogy a gyártó betáplálja azokat a génsorrendeket a számítógépbe, amelyekre kíváncsi /pl. vírusok egyedi génjeit, tumort okozó mutációkat, hisztokompatibilitási HLA-molekulák jellegzetes szakaszait, stb./. A számítógép ezek alapján megtervezi a maszkok perforáltságát, sorrendjét és egy automata szintetizátor létrehozza a „gén-chip”et. Már ma is egy-egy „gén-chip” előállítása igen olcsó és a kereskedelmi ár sem haladja meg a 100 USD-t.


A CHIP ÁLTAL KAPOTT EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE

Az 1-es ábra a számszerű eredményeket tartalmazza. A kísérlet célja volt, hogy megtaláljuk a 9cis reténsav által regulált géneket izolált tímusz sejtekben. 460 db transzkriptet (gén átírat, mRNS) találtunk a vad típusú sejtekben amit a 9cRA regulált. A 3-as ábra mutatja változás eloszlását (Distribution of fold change values between the 460 transcripts). A nur77 transzkripciós faktor hiányos tímusz sejtekből azt tudtuk meg, hogy mennyi olyan transzkript van, amely nur77 függően szabályozott (182 ilyet találtunk). A 4-es ábra bemutatja a szoftvert felületét, amellyel funkciónális csoportokba (GeneOntology besorolásuk szerint) rendeztük a változott transzkripteket. Az 5-ös ábra néhány csoportot mutat ami szignifikánsan változott reténsav kezelés hatására. A 6-os ábra részletesen bemutatja a sejthalál csoportba tartozó géneket WT és KO sejtekben a változás mérétékével együtt. A 7-es ábra egy jeláltviteli útvonalat mutat be, ami változás mutat reténsav kezelésre. A 8-as ábra egy másik szoftver felület és mutatja, amivel további jelátvíteli utakat kerestünk és találtunk is hetet (a t sejt receptor út az utolsó). A 9 és 10-es ábrák két útvonalat mutatnak be ebből a hétből.

Dóri Csaba - kutató tanár és mentor kutató diákjaival közös, hibridizációval kapcsolatos kutatási anyaga ITT megtekinthető.

7. Felhasznált szakirodalomjegyzék

1. Goodman, D.S. Vitamin A and retinoids in health and disease. N. Engl. J. Med. 1994. 310: 1023-1027.
2. Dennert, G. and Lotan, R. Effects of retinoic acid on the immune system: stimulation of T killer cell induction. Eur. J. Immunol. 1978. 8: 23-29.
3. Mangelsdorf, D.J. Vitamin A receptors. Nutr. Rev. 1994. 52: S32-44.
4. Fésüs,L. Szondy, Z. and Uray I./1995/ Probing the molecular program of apoptosis by cancer chemopreventive agents. J. Cell. Biochem. Suppl.22. 151-161.
5. Szondy, Z., Reichert, U., Bernardon, J.M., Michel, S., Tóth, R., Ancian, P. and Fésüs, L. Induction of apoptosis by retinoids and RAR gamma selective compounds in mouse thymocytes through a novel apoptosis pathway. Mol. Pharmacol. 1997. 51: 972-982.
6. Tóth, R, Szegezdi, E., Reichert, U., Bernardon, J.M., Michel, S., Kis-Tóth, K., Mocsári, Z., Fésüs, L. and Szondy, Z. (2001) Activation-induced death and cell surface expression of Fas(CD95) ligand is regulated reciprocally by RAR alpha and gamma and involve nur77 in T cells. Eur.J.Immunol. 31:1382-1391.
7. Tóth, B., Kis-Tóth, K., Kiss, I., Reichert, U., Michel, S., Fésüs, L. and Szondy Z. (2004) Retinoids induce Fas(CD95) ligand cell surface expression via RARg and Nur77 in T cells. Eur. J Immunol 34:827-36
8. Kiss, I., Rühl, R., Szegezdi, E., Fritzsche, B., Tóth, B., Pongrácz, J., Perlmann, T., Fésüs L. and Szondy Z. (2008) Retinoid receptor-activating ligands are produced within the mouse thymus during postnatal development. Eur. J. Immunol. 38(1):147-55.
9. Apoptózis (szerk. Kopper L, Fésüs L) Medicina Könyvkiadó, Budapest, 2002


Miskolc, Debrecen 2008 május 14.