Kutató Diákok Mozgalma

A XIV. Országos Ifjúsági Tudományos és Innovációs Verseny II. díjban részesített pályamunkája

Az újszülött malac agyszöveti Na+-K+-ATPáz aktivitása különbözõ oxigénellátási zavarok után

Írta: Deák Ildikó (2005)

Radnóti Miklós Kísérleti Gimnázium, Szeged

Konzulens: Dr. Bari Ferenc, Bán Sándor; Szegedi Tudományegyetem, ÁOK, Élettani Intézet

Bevezetés

Az anoxia következtében meginduló sejtkárosító folyamat direkt blokkolása, s ennek érdekében a folyamat fõ mechanizmusainak azonosítása napjaink kutatóinak fõ célja. A jelenlegi tanulmányom a Na⁺-K⁺-ATPáz aktivitását vizsgálja az oxigénhiány okozta neurotoxikus kaszkádfolyamatban, s azt, hogy az enzimmûködés változása mennyire tehetõ felelõssé a neurológiai maradványtünetekért.

A születéskori aszfixia világszerte súlyos társadalmi és egészségügyi gondot jelent. Évente körülbelül 4 millió újszülöttet érint, amelynek következményeként 1 millióan meghalnak, és hasonló nagyságrendben van azok száma, akiknél súlyos neurológiai maradványtünetek alakulnak ki.(Agárdi Sz., 2002; Dr Papp Zoltán, 2000) Aszfixia során az újszülöttben hipoxia/iszkémia lép fel, mely a sejt transzportfolyamatait felfüggeszti, valamint számos sejtkárosító mechanizmust indít el (neurotoxikus kaszkád-1. ábra). (Zádor Zsolt, 2004; Horváth Sándor, 2001; Pierre J. Magistretti) Az oxigén és glükózhiány csökkent ATP szintézist eredményez, mely következtében a Na⁺-K⁺-ATPáz aktivitása csökken.

A Na⁺-K⁺-ATPáz (2. ábra) enzim plazmamembránban elhelyezkedõ integráns fehérje, mely mûködéséhez az agyi ATP termelés 40-50%-át használja fel. Az enzim elektrogén transzportja biztosítja a neuronok ingerelhetõségét, és az agyi extra- és intracelluláris folyadéktér homeosztázisát. A két folyadéktér között létrehozott nátrium grádiens segítségével valósulnak meg a sejtmembránon keresztül zajló passzív és facilitált transzport folyamatok. (F. Bari, 2002)

A központi idegrendszer újszülöttkori hipoxiás károsodását leggyakrabban újszülött sertéseken vizsgálják, mert a faj központi idegrendszere mind szövettanilag, mind elektrofiziológiailag jelentõs hasonlóságokat mutat a 36-38. gesztációs hetet betöltött humán újszülöttével. Az állatokon többféle hipoxiás stresszt alkalmaznak különbözõ reperfúziós idõkkel, mert a károsodás egy részrõl a hipoxiás/iszkémiás periódus alatt, másrészrõl a reperfúzió során másodlagosan alakul ki. (Zádor Zs. és mtsai, 2003) Reperfúzió során szabadgyökök lipidperoxidációt okozhatnak (McGowan, 1994). A Na⁺-K⁺-ATPáz membránkötött fehérje, így a szabadgyökök okozta membránkárosodás befolyásolja az enzim aktivitását. A lipidperoxidáció mértékének növekedése az enzimaktivitás csökkenésével járhat. Ez az aktivitáscsökkenés E-vitamin preventív adásával kivédhetõ. (M. Delivoria-Papadopoulos és mtsai, 1995)

A reoxigenizáció módja is hatással lehet a sejtmembrán enzimjeinek aktivitására. Irodalmi adatok szerint 100% oxigénnel végzett újraélesztés után csökken az enzim aktivitása. Ha a lélegeztetés 21% O₂-nel történik, akkor az enzim aktivitása az aszfixia elõtti alapértékre áll vissza. (M. Delivoria, 1995; Temesvári P. és mtsai, 1998)

A Na⁺-K⁺-ATPáz aktivitásáról, anoxiás károsodásáról szóló szakirodalomban nagyon sok új információt találtunk, de ezek alapján számos új kérdés fogalmazódott meg bennünk:

1. Az enzimaktivitását az agykéreg területérõl nyert mintákból határozták meg, ezért más agyterületeken a Na⁺-K⁺-ATPáz enzim aktivitásának hipoxia elõtti és utáni értékeire vonatkozó adatokat nem találtunk.

2. További vizsgálatokban az állatok 40-60 percig tartó hipoxiának lettek kitéve. Ilyen hosszú ideig tartó és ilyen súlyos hipoxia csecsemõknél nehezen elképzelhetõ, rövidebb ideig tartó oxigénhiány okozta változásokról nem rendelkezünk adatokkal, ezért a kísérletek eredményei nem adnak lehetõséget messzemenõ következtetésekre.

3. Más kutatók azt demonstrálták, hogy a Na⁺-K⁺-ATPáz aktivitás csökken hipoxia hatására membránpreparátumokban s ez az aktivitás csökkenés a reperfúzió során is folytatódik, mert a transzportfehérje szerkezete károsodik. Eredményeik azt mutatják, hogy az enzimnek nem áll vissza az aktivitása az eredeti értékre, így a hipoxiás neurológiai diszfunkció lehetséges okozójává nyilvánították az enzimet (Jasenka, 2003; Rosenkrantz és mtsai, 1996, Chang YS, 1998, ).

Célkitûzés

A vizsgálatainkat azért végeztük, hogy megtudjuk károsodik-e a Na⁺-K⁺-ATPáz enzim a különbözõ anoxiás modellekben. A következõ konkrét kérdésekre kerestünk választ:

1. Van-e különbség a különbözõ agyi régiókban az enzim aktivitásában?

2. A különbözõ, rövidebb idõtartamú hipoxiás/iszkémiás modellekben létrejön-e, és ha igen, akkor milyen súlyos a Na⁺-K⁺-ATPáz aktivitási zavara 3 órás túlélést követõen.

3. A további vizsgálatainkat azért végeztük, hogy megtudjuk, csökken-e a Na⁺-K⁺-ATPáz enzimaktivitása rövidebb reperfúzió, vagy hosszabb idõtartamú iszkémia esetén.

Módszer

Mûtéti elõkészítés (3. ábra)

Kísérleteinket 1 napos újszülött malacokon végeztük. A narkózist 35 mg/tskg dózisú Na-thiopenthallal indukáltuk és 70 kg/tskg a-chloralose-val tartottuk fenn. Az állandó hõmérséklet fenntartása ésdekében 37-38 ˚C-osra felfûtött melegítõpárnát alkalmaztunk. Az állatokon helyi érzéstelenítést követõen légcsõmetszést végeztünk, majd az állatokat mesterségesen lélegeztettük. Az a. és v. femoralisba kanülöket vezettünk. Az artériás kanülön keresztül szisztémás vérnyomást regisztráltunk és az innen nyert mintákból végeztük a vérgáz analízist (ABL330-as automata). Az állatok vérnyomását, szívfrekvenciáját, agyi perfúzióját, és intracranialis nyomását folyamatosan regisztráltuk míg a vérgáz paramétereket (pH, P_aCO₂, P_aO₂) 30percenként határoztuk meg.

Kísérleti csoportok

csoport (n=8): kezeletlen kontroll, rajtuk további mûtéti beavatkozást nem végeztünk
csoport (n=10): tagjai 10 globális agyi iszkémia + 3h reperfúzió
csoport (n=18): tagjai 10 percig tartó aszfixia + 3h reperfúzió
csoport (n=8): rajtuk 40-50 percig tartó kétoldali légmell (PTX-et) + 3h reperfúzió
csoport (n=8): 10 perces globális agyi iszkémiát + 1h reperfúzió
csoport (n=4): 45 perces bilaterális communis carotis okklúzió (CCAO) + 15 perces reperfúzió

Hipoxiás modellek

Az állatokon mûtéti elõkészítés után különbözõ súlyosságú hipoxiás modelleket hoztunk létre különbözõ mechanizmusokkal.

3.3.1. Globális agyi iszkémia

A malac fejét mûtéti elõkészítés után sztereotaxikus keretben rögzítettük. A skalp felmetszése után 19mm átmérõjû kör alakú kraniotómiát végeztünk, a dura mater eltávolítása után koponya ablakot helyeztünk a kraniotómiába, melyet fogászati akriláttal rögzítettünk. Ezután az ablakot mesterséges cerebrospinális folyadékkal töltöttük fel. Az agyi erek állapotát ablak fölé helyezett videokamerával és számítógép monitorral összekötött mikroszkóppal vizsgáltuk. Az intracranialis nyomást a subduralis térbe jutatott mesterséges cerebrospinalis liquorral addig növeltük, míg az meg nem haladta az artériás középnyomást s az agyi vérátáramlás meg nem szûnt. Az iszkémia kialakulását intravitális mikroszkópiával igazoltuk. A fokozott koponyaûri nyomás hatására kialakuló reflexes vérnyomásemelkedés ellensúlyozására vénás vért bocsátottunk le, majd a 10 perc iszkémiát követõen az intrakraniális nyomást hagytuk a kiindulási szintre visszatérni, és a heparinizált vért visszajutattuk a keringésbe.

Aszfixia

Az állatok tracheatubusát érfogóval elzártuk, a lélegeztetõ gépet kikapcsoltuk majd 10 perc után újralélegeztettünk.

PTX

A kísérleti állatok mellkasába mindkét oldalon csövet vezettünk, és levegõt jutattunk (5 percenként 10-10ml-t) a virtuális intrapleuralis térbe addig amíg az állatok keringése le nem állt. Ekkor kipréseltük a levegõt a mellkasból, ezt követõen az állatot újraélesztettük. A keringés leállásához 40-50 percig fennálló PTX kellett.

Kétoldali a. carotis comm. okklúzió

Az állatok carotisát mind a két oldalon kipreparáljuk, megtisztítjuk majd 2-2 fonalat vezetünk alájuk. Ezt követõen a fonalakat megemeljük, s megszüntetjük a vérátáramlást 45 percig. Az állatok carotisának okklúziójával egy inkomplett, hosszabb idõtartamú elõagyi iszkémiát hoztunk létre. Tudjuk, hogy hipoxiára az elõagyi területek a legérzékenyebbek, tehát ha – mint azt más kutatók említik- az idegrendszeri károsodásnak tényleg az egyik jelzõje a Na⁺-K⁺-ATPáz enzim károsodása, akkor ezen a területen jelentõs enzimaktivitás csökkenést kellene kapnunk.

Szövetmintavétel

A normális perfúziós viszonyok visszaállítását követõen 1-3 órával, a 45 perces kétoldali carotis occlusion átesett csoportnál 15 perccel, illetve az elsõ csoport tagjainál a mûtéti elõkészítés után közvetlenül, az a. carotis communison keresztül az agyat 4 ^•C-os izotoniás sóoldattal perfundáltuk, majd a koponyából kipreparáltuk. Méréseinkhez szükséges agymintákat 10 régióból vettük: parietális- és occipitalis cortex, pons, cerebellum, medulla oblongata, colliculus superior, hipofízis, periventicularis fehérállomány, thalamus, hippocampus. A mintákat folyékony N₂-ben azonnal lefagyasztottuk és további felhasználásig -80 ^•C-on tároltuk.

Na⁺-K⁺-ATPáz aktivitásának mérése

Az 0.5 g-os agymintákból homogenizátumot készítettünk, majd egy reakcióelegyet adtunk hozzá, amely tartalmazott: 50 mmol/ l-HCL; 100 mmol/ l NaCL; 20mmol/l KCl; 2,5 mmol/ l MgCl₂; 0,25 mmol/ l EDTA; 1 mmol/ l ATP; 1 mmol/ l PEP; 0,16 mmol/ l NADH; 5 kU/l piruvát kináz, 12 kU/l Laktát-dehidrogenáz. A homogenizált mintából a fehérjetartalmat pirogallol-molibdenát segítségével, marha szérum albuminra vonatkoztatva határoztuk meg.

Az enzimaktivitás mérésének elvét a 4. ábrán foglaltuk össze.(Barna Vásárhelyi, 1997)

Spektrofotométerrel (340 nm-en) 20 sec–ként, összesen 10 percen keresztül detektáltuk a reakcióelegyben lévõ NADH abszorbancia csökkenését. A NADH koncentráció változásának ismeretében számítottuk ki az ATPáz aktivitást, amelyet a minta fehérjetartalmára vonatkoztattunk. Az 5. percben Na⁺-K⁺-ATPáz speciális gátlószerét, ouabaint adtunk a reakcióelegyhez. A lejtõ meredeksége az 5. perc elõtt az összes ATPáz enzim aktivitását mutatja, a ouabain hozzáadása után a gátlószerre rezisztens ATPázok aktivitási értékeit (5. ábra) A két görbe meredekségének különbségébõl számítottuk ki a Na⁺-K⁺-ATPáz enzim aktivitását.

Statisztika

Az adatokat átlag ± átlag hibája (SEM) adtuk meg. A különbözõ csoportok enzimaktivitás értékeit egyszempontos varianciaanalízissel értékeltük (SigmaStat, SPSS). Páronkénti összehasonlításhoz a Student-Newman-Keuls post hoc tesztet alkalmaztuk. P<0.05 értéket tekintettünk statisztikailag szignifikánsnak.

Eredmények

Regionális különbségek a Na⁺-K⁺-ATPáz aktivitásban

A vizsgált agyi régiók enzimaktivitás értékei között regionális különbségeket mértünk (6. ábra). A legnagyobb enzimaktivitás értékeket az elõagyi régióban (thalamusban, hippocampusban a parietalis és occipitalis cortexben mértük). Mivel az értékek közel azonosak, ezeket összevontuk és a késõbbiekben elõagyként ábrázoltuk. Az elõagynál szignifikánsan alacsonyabb enzimaktivitást mértünk a pons, a cerebellum és a medulla területén, de ennek a három agytörzsi területnek az enzimaktivitási értékei sem különböznek jelentõsen egymástól, s ezért értékeket összevontuk. A legalacsonyabb enzimaktivitás értékeket a periventicularis fehérállomány és a hipofízis területén mértük.

Az anoxiás stressz hatása a Na⁺-K⁺-ATPáz enzimaktivitásra

A kezeletlen kontrollcsoport, valamint a 10 perc globális agyi iszkémiát 3 órával túlélt állatok enzimaktivitás értékeit összehasonlítva azt a eredményt kaptuk, hogy az iszkémián átesett csoportban 3 órás túlélést követõen az enzimaktivitás értékei nem különböznek jelentõsen a kontroll értékektõl. Mivel ez az eredmény ellent mond korábbi adatoknak, azt feltételeztük, hogy a 10 perc iszkémiát követõ 3 óra reperfúzió esetleg elegendõ lehet az enzimfunkció regenerációjához. Az 5. csoportban ezért az iszkémiát követõen már 1 óra reperfúzió után megvizsgáltuk az enzimaktivitást. Azt az eredményt kaptuk, hogy az enzimaktivitási értékek ebben a csoportban is lényegében megegyeznek mind a kontroll, mind az iszkémiát 3 órával túlélt állatok értékeivel, és az enzimaktivitás regionális különbségei is mindhárom csoportnál lényegileg ugyanolynok. (7.ábra).

Amikor az aszfixián átesett csoport enzimaktivitás értékeit összehasonlítottuk a kontroll és a globális agyi iszkémián átesett csoportok (2., 4.) értékeivel, akkor azt találtuk, hogy a különbözõ csoportok enzimaktivitási értékei között nincs jelentõs különbség.(8. ábra)

A fenti eredmények alapján elmondhatjuk, hogy az enzimaktivitás értékeit rövidebb anoxiás stressz nem változtatta meg.

Az eltérõ eredmények miatt hosszabb, inkomplett, azaz egy területre koncentrálódó 45 perces elõagyi ischaemiát hoztunk létre kétoldali a. carotis communis okklúzióval, 15 perces reperfúzióval. Ezen mintákból nyert enzimaktivitás értékeket összehasonlítva az 10 perces iszkémia+1 órás reperfúziót túlélt állatok mintáinak enzimaktivitási értékeivel és a kontrollértékekkel, szintén nem találtunk jelentõs aktivitás változást. (9. ábra)

Eredmények összegzése

Munkánk legfontosabb eredményei a következõk

Az agyi Na⁺-K⁺-ATPáz enzim aktivitásában normoxiás körülmények között regionális különbségek találhatók.
Rövid ideig (10 perc) tartó globális vagy hosszabb ideig tartó (45 perc) inkomplett elõagyi iszkémia nem változtatta meg az enzimaktivitás értékeit azonban a regionális különbségek megmaradtak.
A kétoldali légmellel létrehozott súlyos aszfixia – mely 40-60 perc keringésleálláshoz vezetett – is csupán az enzimaktivitás kismértékû, nem szignifikáns csökkenését okozta.
Az enzimaktivitást nem változtatta meg sem az 1 órás sem a 3 órás túlélés 10 perces globális agyi iszkémiát követõen , tehát aktivitás értékeire nem volt hatással a reperfúzió hossza.

Megbeszélés

Adataink ismeretében valószínûsíthetjük, hogy a Na⁺-K⁺-ATPáz enzimaktivitás regionális különbségeit az agyi anoxia különbözõ formái nem befolyásolják. Az agyi vér és oxigénellátás zavara által létrehozott központi idegrendszeri károsodásokért feltehetõen nem a Na⁺-K⁺-ATPáz fehérjemolekula sérülése tehetõ felelõssé. Az enzim mûködésének zavaráért más endogén okok – pl. ATP hiánya – okozhatják.

Az eredményeink ellentétesek más kutatók eredményeivel. Az általunk ismert szakirodalomban több szerzõ az enzimaktivitás csökkenésérõl számolt be anoxiát követõen. Az eltérõ eredmények lehetséges okai:

Agyminták eltérõ elkészítése során károsodhatott az enzim ATP-t bontó szakasza, vagy egy másik, Na⁺ vagy K⁺ szállításáért felelõs citoplazmatikus transzmembrán szakasz. Ilyen károsodást okozhat a lipidperoxidáció, nagyobb tf%-os oxigénnel történõ újralélegeztetés során (Jasenka, 2003, Delivoria, 1995) vagy az, hogy Rosenkrantz és mtsai (1996) membránpreparátumokból határozták meg az enzimaktivitást. Egy ilyen agyszöveti membránpreparátum készítés során, olyan mechanikai hatások érhetik az enzimet, amely károsítja egyik alegységét. Arra sem találtunk adatokat, hogy mások perfundálták-e az újszülött malac agyát a mintavétel elõtt. Perfundálás nélkül a mintában maradó vér a vörösvérsejtek nagy Na⁺-K⁺-ATPáz tartalma miatt megváltoztathatták ugyanis az eredményeket.

Összefoglalás

Megállapíthatjuk, hogy az általunk alkalmazott eltérõ hypoxiás/anoxiás stressz állapotok nem károsítják a Na⁺-K⁺-ATPáz enzimet. Ex vivo méréseink szerint az enzim a reperfúziót követõ

1-3. órában mûködõképes. Amennyiben be is következik az ion pumpafunkció károsodása, akkor azt nem az ATPáz aktivitás csökkenése okozza. Ezen eredmények alapján megállapíthatjuk, hogy a Na⁺-K⁺-ATPáz enzimaktivitásának csökkenése nem lehet oka a neuronális-vaszkuláris károsodásnak.

Köszönetnyilvánítás

Legelõször szeretnék köszönet mondani, Dr. Bari Ferencnek, hogy felkeltette érdeklõdésemet a téma iránt és lehetõséget biztosított számomra a kutatómunkába való betekintéshez.

Szeretném megköszönni Dr. Domoki Ferencnek és Zimmermann Alíznak a dolgozat elkészítésében nyújtott segítségüket.

Szakirodalom

Ádám V., Faragó A., Machovich.: Orvosi Biokémia
Ádám Veronika: Membrántranszportfolyamatok
Agárdi Szilvia: Agyszöveti Na⁺-K⁺-ATPáz aktivitása különbözõ oxigénhiányos modellekben (szakdolgozat)
Bari F, Errico RA, Louis TM, Busija DW.: Influence of hypoxia/ischemia on cerebrovascular responses to oxytocin in piglets, abstract, J Vasc Res. 1997 Jul-Aug;34(4):312-20.
Barna Vásárhelyi, Teréz Szabó, Ágota Vér and Tivadar Tulassay, Measurement of Na⁺/K⁺-ATPase Activity with an Automated Analyzer, Clinical Chemistry. 1997;43:1986-1987
F. Bari, K. Lazics, F. Domoki, S. Agárdi, S. Pelikán, B. Vásárhelyi, P. Temesvári: Unaltered cerebral Na⁺,K⁺-ATPase activity after hypoxic/ischemic injury in piglets, Neuroscience Letters 329 (2002) 189-192
Ferenc Bari, PhD; Robert A. Errico, MD; Thomas M. Louis, PhD; David W. Busija, PhD: Differential Effects of Short-term Hypoxia and Hypercapnia on N-Methyl-D-Aspartate–Induced Cerebral Vasodilatation in Piglets, Stroke. 1996;27:1634-1640
Gerald A. Dienel: Energy generation in the central nervous system
Horváth Sándor dr.: A krónikus agyi keringészavarok patológiai és klinikai következményei, Orvosi Hetilap 2001, 142 (7), 323-329
J.M. Goplerud, S. Kim, M. Delivoria-Papadopoulos: The effect of post-asphyxial reoxigenation with 21% vs. 100% oxygen on Na⁺,K⁺-ATPase activity in striatum of newborn piglets
Jasenka Mrsic-pelcic, Goran Pelcic, Dinko Vitezic, Igor Antoncic, Tatjana filipovic, Ante Simonic, Gordana Zupan: Hyperbaric oxygen treatment: the influence on the hippocampal superoxid dismutase and Na⁺,K⁺-ATpase activities in global cerebral ischaemia-exposed rats
McGowan JE, McGowan JC 3rd, Mishra OP, Delivoria-Papadopoulos M., Effect of cyclooxygenase inhibition on brain cell membrane lipid peroxidation during hypoxia in newborn piglets., Biol Neonate. 1994;66(6):367-75.
Papp Zoltán dr.: Érett újszülöttek postasphyxiás eredetû születési károsodása és megelõzésének esélyei
Pierre J. Magistretti, Luc Pellerin, and Jean-Luc Martin : Brain Energy Metabolism, An Integrated Cellular Perspective
Rosenkrantz TS, Kubin J, Mishra OP, Smith D, Delivoria-Papadopoulos M: Brain cell membrane Na⁺,K⁺-ATPase activity following severe hypoxic injury in the newborn piglet., abstract, Brain Res. 1996 Aug 19;730(1-2):52-7.
Temesvári Péter dr., Karg Eszter dr., Bódi István dr., Németh Ilona dr., Pintér Sándor dr., Lazics Klaudia dr., Domoki F. dr., Bari Ferenc dr.: Újszülöttkori asphyxiát követõ reoxigenizáció sertéseken 21% vagy 100% oxigénnel, Orvosi Hetilap
Zádor Zsolt, Benyó Zoltán, Lacza Zsombor, id, Hortobágyi Tibor, Harkány Tibor, Hortobágyi Tibor: Neuroprotekció agyi ischaemiában- Kételyek és remények, Ideggyógyászati Szemle 2004; 57 (3-4): 81-93